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    影響限制性內切酶活性的因素

    發布時間: 2022-05-16  點擊次數: 37次
      影響限制性內切酶活性的因素
      1、DNA純度
      在DNA樣品中若含有蛋白質,或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子,均會降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用.
      2、核酸內切限制酶的緩沖液
      核酸內切限制酶的標準緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等.
      使用所有限制酶均可發揮活性的一種緩沖液.
      不同限制性內切酶對NaCl濃度的要求不同,這是不同限制酶緩沖液組成上的一個主要的不同.據此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液,在進行雙酶解或多酶解時,若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好,則幾種酶可同時酶切;若這些酶所要求的緩沖液有所不同,可采用以下三種方法進行消化反應:先用要求低鹽緩沖液的限制性內切酶消化DNA,然后補足適量的NaCl,再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化;
      先用一種酶進行酶解,然后用乙醇沉淀酶解產物,再重懸于另一緩沖液中進行第二次酶解.
      3、酶切消化反應的溫度
      DNA消化反應的溫度,是影響限制內切酶活性的一個重要因素.不同的核酸內切限制酶,具有各自的最適反應溫度.多數限制內切酶的最適反應溫度是37℃,少數限制性內切酶的最適反應溫度高于或低于37℃.
      4、DNA的分子結構
      DNA分子構型對核酸內切限制酶的活性有很大影響,如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍.
      有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點,其效率也有明顯差異.
      限制性內切酶反應的終止 通常是采用65℃條件下溫浴5min;
      加終止反應液(如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10 mol/L)螯合Mg2 ,以終止反應.
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