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    PCR儀有關的分子信標技術介紹

    發布時間: 2021-12-20  點擊次數: 226次
       隨著PCR技術的發展與廣泛應用,利用PCR的定量技術也取得了長足的發展。早期主要采用外參照的定量PCR方法,這種方法因影響因素較多,現已逐漸被內參照物定量方法和競爭PCR定量方法所取代,并在此基礎上發展了熒光定量PCR儀方法,使PCR定量技術提升到新的水平。
      分子信標技術也是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和猝滅分子。通常,分子信標探針長約25核苷酸,空間上呈莖環結構。與TaqMan探針不同的是,分子信標探針的5'和3'末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構,此時熒光分子和猝滅分子鄰近,因此不會產生熒光。當溶液中有特異模板時,該探針與模板雜交,從而使探針的發夾結構打開,于是溶液便產生熒光。熒光的強度與溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR儀的定量分析。該方法的特點是采用非熒光染料作為猝滅分子,因此熒光本底低。
      常用的熒光猝滅分子對是5'-(2'-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和4'-(4'-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(DAB-CYL),采用DAB-CYL作猝滅劑是由于它對多種熒光素都有很強的猝滅效率。當受到336nm紫外光激發時,EDANS發出波長為490nm的亮藍熒光;DAB-CYL的是非熒光分子,但其吸收光譜與EDANS的發射熒光光譜重疊。只有分子信標時,EDANS和DAB-CYL的距離非常接近,足以發生FRET,EDANS受激發產生的熒光轉移給DAB-CYL并以熱的形式散發,不能檢測到熒光;相反,當有靶核酸存在時才可檢測到熒光。
      分子信標技術的不足之處是:
      雜交時探針不能完全與模板結合,因此穩定性差;
      探針合成時標記較復雜。分子信標技術結合不同的熒光標記,可用于基因多突變位點的同時分析。
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